一、参考标准

　　食品国标GB4789.3-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》定义，大肠菌群在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

　　大肠菌群计数有两种方法：

　　方法一：MPN法，适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数。

　　方法二：平板计数法，适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。

　　二、检验流程

　　(一)MPN法

　　1、初发酵试验

　　每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤，每管接种1 mL(，36℃±1℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。

　　注意事项：液体样品可以选择原液;若是接种量需要超过1 mL，则用双料LST肉汤。

　　根据标准菌株对月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤培养基进行验证，结果如图一：

　　a:大肠埃希氏菌ATCC25922，b:阴沟肠杆菌ATCC23355，

　　c:弗氏柠檬酸盐杆菌ATCC43864，d:粪肠球菌ATCC29212，e:空白对照

　　图一 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤微生物质控结果

　　2、复发酵试验

　　用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,36℃±1℃培养48h±2h,观察产气情况。产气者,即为大肠菌群阳性管。

　　根据标准菌株对BGLB肉汤培养基进行验证，结果如图二：

　　图二 BGLB肉汤微生物质控结果

　　3、结果判定

　　根据证实为大肠菌群的阳性管数，查大肠菌群最可能数(MPN)检索表，报告每g (mL)大肠菌群的MPN值。

　　确定最适的三个连续稀释度方法，在10-1～10-5五个连续稀释度中确定最适的三个连续稀释度方法如下：

　　a)有一个以上的稀释度3管均为阳性。选择三管都是阳性结果的最高稀释度及其相连的两个更高稀释度(见示例a、b，表中带下划线的数字对应的接种样品量为最终选取的最适稀释度，下同);

　　b)在未选择的较高稀释度中还有阳性结果时，则顺次下移到下一个更高三个连续稀释度(见示例c);

　　如果中间有某个稀释度没有阳性结果，但更高稀释度有阳性结果，则将此阳性结果加到前一稀释度，进而确定三个连续稀释度(见示例d);

　　如果不能按照这个原则找到三个合适的稀释度，则选择前一个较低的稀释度(见表示例e);

　　c)没有任何一个稀释度3管均为阳性。如果没有一个稀释度的3管均为阳性，则选择三个最低稀释度(见示例f);

　　如果在更高的没有被选择的稀释度还有阳性结果，将此阳性结果加到选择的最高稀释度，进而确定三个连续稀释度(见示例g)。

　　每g(mL)检样中大肠菌群最可能数(MPN)的检索表

　　举例说明：若粪大肠菌群的阳性管数的示例为3-3-2-0-1，则选择的稀释度为3-2-1，根据MPN检索表所得MPN数值为1500。

　　(二)平板计数法

　　1、平板计数：

　　选取2～3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。结果如图三。

　　图三

　　注意事项：选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，菌落形态应为为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm或更大,最低稀释度平板低于15CFU的记录具体菌落数。

　　2、证实试验：

　　从VRBA 平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于BGLB肉汤管内,36℃±1℃培养24h～48h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。

　　3、平板计数法计数结果：

　　经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g(mL)样品中大肠菌群数。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

　　举例说明：10-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。